1 引言
依賴于微生物的厭氧消化作用能夠?qū)⒍喾N有機(jī)廢水和固體廢物轉(zhuǎn)化為甲烷、氫氣等清潔能源，是一種環(huán)境友好型的新能源生產(chǎn)途徑，也是目前處理工農(nóng)業(yè)有機(jī)廢物的一個(gè)重要手段.厭氧消化的核心是微生物群，因此，獲得高活性的厭氧消化菌群是有效轉(zhuǎn)化有機(jī)廢棄物為能源物質(zhì)的重要保障.生物反應(yīng)器內(nèi)的厭氧消化菌群具有復(fù)雜的組成，通常被劃分為3類，即酸化菌群、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群以及產(chǎn)甲烷菌群.其活性受多種因素影響，包括反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)、pH值、水力停留時(shí)間等.Nadarajah等認(rèn)為溫度是厭氧消化菌群的重要影響因子，將影響生物反應(yīng)器內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)、化學(xué)需氧量(Chemical
Oxygen Demand，COD)去除率、出水懸浮固體(Effluent Suspended Solids，ESS)和污泥指數(shù)(Sludge
Volume Index，SVI)等.
通常厭氧消化作用在2個(gè)溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，即中溫厭氧消化和高溫厭氧消化.良好高溫厭氧消化菌群在馴化之初，菌源常取自于自然環(huán)境如土壤、河道底泥、牛羊糞便以及常溫活性污泥等.在提升溫度的富集培養(yǎng)過程中，逐漸形成穩(wěn)定的厭氧消化菌群.Pettersson等的研究認(rèn)為，培養(yǎng)溫度改變會(huì)給菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)整帶來新的選擇壓力.溫度轉(zhuǎn)變幅度越大，這種選擇壓力越強(qiáng)烈，并增加菌群結(jié)構(gòu)調(diào)整的幅度.同時(shí)，溫度可能影響菌群變化的周轉(zhuǎn)速率，高的周轉(zhuǎn)速率使菌群更加快速的更換掉不適應(yīng)新溫度的菌群.Zheng等利用分子生物學(xué)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫的產(chǎn)甲烷古菌可存在于常溫厭氧反應(yīng)器中，反之亦然，而其生物量取決于培養(yǎng)溫度.Ahring探索了高溫厭氧消化過程溫度變化對菌群生物量的影響，結(jié)果顯示當(dāng)將一個(gè)連續(xù)攪拌反應(yīng)器的培養(yǎng)溫度從55
℃提高到65 ℃，細(xì)菌的生物量將有明顯的下降，而古菌的生物量會(huì)有上升，當(dāng)溫度達(dá)到65 ℃時(shí)，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌具有明顯的生物活性.
可見，溫度的轉(zhuǎn)變對厭氧消化菌群結(jié)構(gòu)和功能都有強(qiáng)烈的影響.為了減少溫度對厭氧消化菌群的沖擊，在厭氧生物反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)通常采用梯度升溫的方法(韓育宏等，2009).本研究則利用37
℃的中溫厭氧消化菌群直接轉(zhuǎn)入50
℃培養(yǎng)，并通過連續(xù)進(jìn)料糖蜜有機(jī)廢水馴化高溫厭氧消化菌群，進(jìn)而考察高溫馴化過程中菌群結(jié)構(gòu)、多樣性及功能的變化特征.研究結(jié)果對闡明厭氧發(fā)酵菌群在溫度劇烈變化帶來的選擇壓力下菌群結(jié)構(gòu)與功能的變化趨勢，對改進(jìn)高溫厭氧消化菌群富集方法具有重要意義.
2 材料與方法
2.1 厭氧反應(yīng)器運(yùn)行條件
400 mL實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的中溫(37 ℃)厭氧消化秸稈、豬、牛糞便的活性污泥注入1 L自制厭氧反應(yīng)器中，自來水補(bǔ)充至800
mL，放置于50 ℃條件下培養(yǎng).高濃度糖蜜有機(jī)廢水(100000 mg·L-1 COD)(李杰等，2011)作為厭氧消化原料，每2
d進(jìn)料1次，每次30 mL(水力停留時(shí)間(Hydraulic Retention Time，HRT)=27 d).每次進(jìn)料前從反應(yīng)裝置中抽出30
mL厭氧消化液，用于理化指標(biāo)與微生物多樣性分析，以及維持反應(yīng)體系體積平衡，厭氧反應(yīng)器裝置見圖 1.
圖 1厭氧消化反應(yīng)器(A：進(jìn)/取料口, B：出氣口, C：厭氧發(fā)酵瓶, D：緩沖裝置, E：集氣袋, F：連接管)
2.2 理化指標(biāo)分析
1)pH 取待測液0.5 mL，用日本HORIBA B-212型微量pH計(jì)(Compact pH meter，model B-212，Japan)測定pH值.
2)化學(xué)需氧量(COD)0.25 mmol·L-1 K2Cr2O7 溶液與Ag2SO4 溶液(Ag2SO4
/濃H2SO4質(zhì)量體積比=1/100)按體積比1:3混合，記為溶液A.取2 mL 待測樣品、3 mL
溶液A、少許HgSO4(屏蔽Cl-)，加入10 mL 消解管中，在消解儀上消解(150 ℃)2
h.消解的樣品冷卻后利用分光光度計(jì)測定樣品OD值.空白控制使用蒸餾水替代樣品溶液.
3)沼氣總量及甲烷含量 每日生產(chǎn)沼氣使用集氣袋收集，利用排水集氣法測定總量.沼氣中甲烷含量用英國Geotech 公司的沼氣成分測定儀(型號(hào)為Biogas Check)測定.
4)總固體(Total Solids，TS)含量和揮發(fā)性固體(Volatile Solid，VS)含量 采用重量法測定.
5)揮發(fā)性有機(jī)酸(Volatile Fatty Acid，VFA)含量 1 mL消化液10000 r·min-1離心15
min，取0.5 mL上清，加入0.5 mL乙氰，充分混勻后，冰上保持10 min，10000 r·min-1離心15 min后過0.22
μm去除蛋白.前處理樣品檢測有機(jī)酸，使用LC/MS-2010A高效液相色譜(Shimadzu，Kyoto，Japan).檢測條件為：10
μL樣品注入儀器檢測，檢測柱為Aminex HPX-87H Column(Bio-Rad，CA，USA)，0.05 mmol·L-1
H2SO4為流動(dòng)相.洗脫程序?yàn)?.6 mL·min-1 5 min，0.4 mL·min-1 30 min，0.6 mL·min-1 5
min.柱溫40 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器.
2.3 微生物多樣性分析
1)DNA提取及PCR條件
冰凍保存樣品利用淤泥基因組DNA快速提取試劑盒(BioTeke，百泰克生物技術(shù)有限公司，北京)提取總DNA，方法按說明.抽提的總DNA利用引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50
μL):模板DNA 10 ng，10 ×PCR Gold Buffer 5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2，3 μL，dNTP
mix(各2 mmol·L-1)5 μL，45 μmol·L-1 引物(27f和906r)各0. 5 μL，5 Unit Ampli Taq
Gold 0. 2 μL.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30
s，共22個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸5 min.PCR產(chǎn)物用15 mg·mL-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測.
2)變性梯度凝膠電泳(DGGE)提取厭氧消化菌群DNA，利用PCR儀擴(kuò)增菌群16S
rDNA基因片段片段(使用引物，細(xì)菌：357F-GC，517 R;古菌：A348IF，U806IR-GC).使用DcodeTM
Universal Mutation Detector System(BIO-RAD
Laboratories，Hercules，CA，USA)對所獲DNA片段進(jìn)行凝膠電泳.變性膠1 mm
厚，Polyacrylamide濃度梯度6%~12%(W/V)，0.5× TAB Electrophoresis Buffer(20
mmol·L-1 Tris-HCl，pH值 8.3，10 mmol·L-1 acetic acid，0.5 mmol·L-1
EDTA)，變性劑尿素梯度20%~55%(含有40%甲酰胺，7 mol·L-1尿素).電泳電壓200 V，溫度為61 ℃，時(shí)間5
h.電泳結(jié)束后用SYBR Green I(Molecular Probes，Eugene，OR.)染色，觀察和照相使用Alpha
Innotech凝膠成像儀.根據(jù)電泳條帶，分析菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.
3)克隆文庫 將純化后的PCR產(chǎn)物(使用引物，細(xì)菌：27F，907R;古菌：109F，912R)連接到pGEM-T Easy載體，4
℃過夜，然后通過在42 ℃ 熱激 45 s轉(zhuǎn)化到E.coli
JM109菌體內(nèi);通過X-Gal和IPTG的α-互補(bǔ)作用篩選出白色菌落.并將白色菌落轉(zhuǎn)移到新鮮的含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，編碼建立克隆文庫.利用變性梯度凝膠電泳(Denaturing
Gradient Gel
Eletrophoresis，DGGE，變性劑濃度范圍設(shè)為20%~60%)篩選出不同種類的克隆子.對含有目標(biāo)克隆子的菌體，用堿裂解法提取質(zhì)粒，并測序.利用GenBank(NCBI，進(jìn)行相似菌株檢索，獲取近緣菌株相關(guān)序列.應(yīng)用DNA序列分析軟件DNA
Star 7.0和MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列拼接，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法).
4)定量PCR 古菌總量定量PCR采用Platinum ? SYBR ? Green qPCR
SuperMIx-UDG試劑盒.反應(yīng)體系(20μL)為：2×Platinum SYBR ? Green qPCR SuperMix-UDG，10
μL;50 mmol·L-1 MgCl2，1.2 μL;Forward and Reverse specific primers(10
pmol·μL-1)，各0.4 μL;DNA，1 μL;Rox，0.4 μL;PCR grade distilled water 7.8
μL.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，使用含有被檢測菌株目標(biāo)片段克隆子的pGEM-T
Easy質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，用熒光定量儀精確測定標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，并計(jì)算其拷貝數(shù).將稀釋成不同數(shù)量級(jí)拷貝數(shù)的梯度標(biāo)準(zhǔn)液，與被測樣品一同使用ABI
Prism ? 7500型熒光定量PCR儀(ABI，USA)進(jìn)行PCR及熒光檢測.擴(kuò)增程序采用ABI儀器的標(biāo)準(zhǔn)程序：50 ℃持續(xù) 2
min(UDG孵育)→ 95 ℃持續(xù)2 min → 40個(gè)循環(huán)：95 ℃，15 s;60 ℃，30 s.熒光檢測器在60
℃時(shí)測定體系熒光強(qiáng)度.數(shù)據(jù)分析，通過Ct值確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)數(shù)值的優(yōu)良，最終獲取待測樣品拷貝數(shù)(生物量).Methanomicrobiales(MMB)，Methanococcales(MCC)，Methanosaetaceae(MST)分析使用TaqMan
? Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，USA)試劑盒分析，反應(yīng)體系為PCR-grade
water，5 μL;Forward and ，各1 μL;對應(yīng)TaqMan探針(1 μmol·L-1)1 uL;2×TaqMan ?
Universal PCR Master Mix，10 μL; DNA，1 μL.其他同Platinum ? SYBR ? Green qPCR
SuperMIx-UDG試劑盒反應(yīng).其中MMB退火溫度為63 ℃.
3 結(jié)果
3.1 高溫馴化過程中COD、pH值和菌群產(chǎn)沼氣量、甲烷含量變化
將來自于實(shí)驗(yàn)室的37 ℃條件下運(yùn)行的禽畜糞便厭氧消化產(chǎn)甲烷菌群直接轉(zhuǎn)移至50
℃條件下培養(yǎng)，處理高濃度有機(jī)廢水.高溫馴化期間，厭氧消化菌群的產(chǎn)氣量、甲烷含量、pH值及COD等理化特征指標(biāo)被檢測(圖
2).結(jié)果表明中溫的厭氧產(chǎn)甲烷菌群轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)的前7 d即開始產(chǎn)氣，平均日產(chǎn)氣量為115 mL·d-1，20
d后，產(chǎn)氣量進(jìn)入高峰期，平均日產(chǎn)氣量超過360 mL·d-1.最高日產(chǎn)氣量出現(xiàn)在培養(yǎng)的第31 d，達(dá)到410 mL·d-1(圖
2d).培養(yǎng)期間總計(jì)產(chǎn)氣量為9735 mL(圖 2d)，平均COD轉(zhuǎn)化效率為162.5
mL·g-1.甲烷含量的變化趨勢與平均日產(chǎn)氣量相似，初期甲烷含量較低(18.9%)，20
d后，甲烷含量維持在34%以上.反應(yīng)器內(nèi)的COD含量在產(chǎn)氣期間穩(wěn)定在6800~7700 mg·L-1(圖
2a)，pH值維持在7.3~8.1之間(圖
2b).4個(gè)參數(shù)的檢測結(jié)果表明厭氧消化菌群被轉(zhuǎn)至高溫條件下馴化培養(yǎng)，能夠快速啟動(dòng)，并連續(xù)、穩(wěn)定地處理高濃度有機(jī)廢水產(chǎn)生沼氣.
圖 2高溫馴化厭氧消化菌過程中COD、pH值和菌群產(chǎn)沼氣量、甲烷含量變化(注：本研究中0 d樣品為30 ℃培養(yǎng)的原始厭氧消化液，其他時(shí)間為轉(zhuǎn)移至50 ℃后的厭氧消化液樣品，下同.)
3.2 高溫馴化厭氧消化菌群過程中有機(jī)酸含量變化
丙酸和乙酸是發(fā)酵液中含量最高的兩類有機(jī)酸(圖 3).丙酸含量在啟動(dòng)前期占有明顯的優(yōu)勢，最高值為784.7 mg·L-1(第15
d)，當(dāng)反應(yīng)器運(yùn)行狀態(tài)穩(wěn)定后，丙酸含量顯著下降，在培養(yǎng)的第30 d，降低至25.3
mg·L-1.乙酸是產(chǎn)甲烷古菌合成甲烷的重要底物，反應(yīng)器內(nèi)乙酸的積累及轉(zhuǎn)化速度常常反應(yīng)了厭氧消化菌群生產(chǎn)甲烷的狀態(tài).在反應(yīng)器啟動(dòng)前期，發(fā)酵液內(nèi)出現(xiàn)乙酸積累現(xiàn)象，并隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，在第15
d含量達(dá)到439.3 mg·L-1.進(jìn)入產(chǎn)氣高峰后，反應(yīng)體系內(nèi)的乙酸含量明顯降低，在培養(yǎng)的第30 d，乙酸含量減少至145.3
mg·L-1.甲酸和乳酸在發(fā)酵液中的含量較少，其中乳酸質(zhì)量濃度18~81 mg·L-1之間，甲酸僅在發(fā)酵前期被檢測到，質(zhì)量濃度約在16~18
mg·L-1之間.
圖 3厭氧消化過程有機(jī)酸含量變化
3.3 高溫馴化厭氧消化菌群過程中菌群結(jié)構(gòu)分析
反應(yīng)器運(yùn)行期間，厭氧消化菌群中細(xì)菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)利用DGGE技術(shù)進(jìn)行分析.結(jié)果顯示，在細(xì)菌菌群的DGGE圖譜中，大量的高亮條帶存在于每個(gè)泳道內(nèi)，表明細(xì)菌菌群的多樣性十分豐富(圖
4a、4b)，而古菌菌群的高亮條帶相對于細(xì)菌菌群明顯減少.在反應(yīng)器運(yùn)行期間，無論細(xì)菌還是古菌菌群，都存在一些條帶的消失和出現(xiàn)的狀況.在細(xì)菌菌群中約有7個(gè)主要條帶出現(xiàn)(“△”指示部分，下同)，7個(gè)主要條帶消失(“
”指示部分，下同);古菌菌群中約有9個(gè)主要條帶出現(xiàn)，4個(gè)主要條帶消失.表明，轉(zhuǎn)變培養(yǎng)溫度后，細(xì)菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)明顯變化，菌群內(nèi)微生物的生物量和種類呈現(xiàn)大幅的調(diào)整，以適應(yīng)新的溫度條件.
圖 4 DGGE技術(shù)分析細(xì)菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)(注：a. 細(xì)菌不同培養(yǎng)時(shí)間的DGGE圖像;b. 古菌不同培養(yǎng)時(shí)間的DGGE圖像，“△”指示新增條帶，“ ”指示消失條帶;c. 細(xì)菌DGGE圖像的聚類分析;d. 古菌DGGE圖像的聚類分析，采用Quantity One 4.3軟件UPGMA分析.)
利用Quantity
One軟件對反應(yīng)器菌群DGGE圖片中的條帶圖形進(jìn)行分析，所獲數(shù)據(jù)利用UPGAMA方法進(jìn)行聚類分析繪制成系統(tǒng)樹，結(jié)果見圖
4c.細(xì)菌菌群的DGGE圖譜被劃分入4個(gè)族，0、7、15 d圖譜分別屬于A、B、C 3個(gè)族，22、30、39
d圖譜被劃歸入D族，表明在轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)的前22 d，發(fā)酵體系內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，以適應(yīng)新溫度帶來的選擇壓力.22
d后，菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定.古菌菌群的DGGE圖譜被劃歸入3個(gè)族(圖 4d)，0 d譜圖劃歸為A族，7 d和15 d圖譜劃歸入B族，22、30和39
d圖譜劃歸入C族.表明改變溫度培養(yǎng)后，古菌菌群結(jié)構(gòu)即產(chǎn)生變化.菌群結(jié)構(gòu)的變化程度弱于細(xì)菌，且變化主要集中在培養(yǎng)的前7
d.與細(xì)菌相似，古菌菌群結(jié)構(gòu)自22
d后進(jìn)入穩(wěn)定階段，直至培養(yǎng)結(jié)束，菌群結(jié)構(gòu)沒有出現(xiàn)顯著的差異.通過細(xì)菌和古菌DGGE圖譜變異分析結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)，中溫厭氧消化菌群轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)后，菌群結(jié)構(gòu)將會(huì)發(fā)生顯著的變異，這種菌群結(jié)構(gòu)的變異將會(huì)持續(xù)20
d左右，這與反應(yīng)體系沼氣產(chǎn)量相吻合(圖
2d).細(xì)菌的變遷程度相對于古菌更加劇烈，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是由于細(xì)菌菌群的多樣性較古菌菌群更為豐富所引起的.這一分析結(jié)果可由針對DGGE圖譜的主成分分析更為形象的說明(圖
5).
圖 5(Fig. 5)
圖 5細(xì)菌和古菌DEEG條帶變化的主成分分析(注：圖中Ba為細(xì)菌，Ar為古菌，數(shù)值為培養(yǎng)時(shí)間)
主成分分析常用來分析菌群結(jié)構(gòu)變化.在本研究中，細(xì)菌和古菌菌群的分析結(jié)果被提取了3個(gè)主成分，其累積方差為73.2%(主成分1、2、3分別為32.1%、28.1%、13.0%).圖
5為3個(gè)主成分的載荷圖，元素類型矩陣.圖中結(jié)果顯示，細(xì)菌菌群和古菌群在圖中能夠較為明顯的被區(qū)分.與古菌菌群相比，細(xì)菌菌群在轉(zhuǎn)變培養(yǎng)溫度后菌群結(jié)構(gòu)方差值更為分散，表明細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)變異更為強(qiáng)烈.轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)后，2組菌群的菌群結(jié)構(gòu)與原始培養(yǎng)溫度均產(chǎn)生了明顯的變化，在圖中則表現(xiàn)為0
d的菌菌群結(jié)構(gòu)和后期培養(yǎng)的菌群結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了較遠(yuǎn)的變異距離.
3.4 高溫馴化厭氧消化菌群過程中菌群多樣性分析
厭氧消化菌群的16S rRNA基因片段利用克隆方法被獲取，并建立克隆文庫、繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，獲取菌群內(nèi)菌群多樣性信息.
圖
6a顯示厭氧消化菌群中細(xì)菌菌群的系統(tǒng)發(fā)育特征.所有細(xì)菌菌群劃入7個(gè)族，包括Caloramator、Thermoanaerobacter、Peptococcaceae、Thermacetogenium、Acetomicrobium、Soehngenia、Bacteroides.其中Ba4族主要為Thermacetogenium菌，在菌群中的比例最多，達(dá)到33.44%.第4族中的類似菌株Thermacetogenium
phaeum strain PB.分離于55
℃高溫的厭氧反應(yīng)器，能夠與嗜熱氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌共生而氧化乙酸.Bac5在細(xì)菌菌群中的比例約為20.99%.此族的已知代表菌株為Acetomicrobium
faecal，該菌發(fā)現(xiàn)于下水道污泥，它能夠代謝多種己糖和戊糖為乳酸、乙酸、乙醇、CO2等.此外，Bac3、Bac1、Bac7等族的菌株在厭氧消化菌群中占有較大比例，分別為13.5%、12.35%、12.34%.它們多數(shù)發(fā)現(xiàn)于高溫厭氧環(huán)境.
圖 6細(xì)菌、古菌菌群16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析
厭氧消化菌群中的古菌菌群被劃分為4個(gè)族(圖
6b)，其中Arc2為4族中最為豐富的古菌菌群，豐度為檢測古菌總量的56.4%，代表菌株Methanosaeta
concili是一類能夠利用乙酸作為唯一能源底物代謝產(chǎn)生等量的CH4和CO2.能夠利用甲酸、乙酸和CO2作為碳源而生長.Arc1在古菌clone文庫中所占的比例為39.75%，代表菌株為Methanoculleus，該菌株能夠利用H2/CO2作為底物而生長并產(chǎn)生甲烷.一些菌種還需要乙酸作為生長因子.此外，還有一些厭氧產(chǎn)甲烷古菌及Methanococcus(Arc3和Arc4)被檢測到，它們在clone文庫中的比例分別為2.56%和1.28%.Jones的研究發(fā)現(xiàn)Methanococcus是一種產(chǎn)甲烷古菌，能夠利用H2和CO2生成甲烷.Arc3中的近緣古菌為Chin所報(bào)道，是通過克隆文庫方法于水田土壤中發(fā)現(xiàn)的菌株.
可見，轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)后，菌群中主要的構(gòu)成菌株轉(zhuǎn)換成為能夠在高溫條件下生長并與糖、多種有機(jī)酸代謝相關(guān)的細(xì)菌菌株以及產(chǎn)甲烷古菌菌株.正是由于這些菌株的穩(wěn)定存在，才能夠維持菌群在高溫條件下穩(wěn)定消化有機(jī)廢水生成沼氣.
3.5 高溫馴化厭氧消化菌群過程中主要菌株的定量分析
產(chǎn)甲烷古菌的總生物量及一些典型的產(chǎn)甲烷古菌的生物量可以利用熒光定量PCR方法進(jìn)行定量分析.結(jié)果顯示，厭氧消化菌群從37 ℃轉(zhuǎn)移至50
℃，產(chǎn)甲烷古菌的總生物量減少(圖 7c)，并在22 d后進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)，含量約為7.6×106
拷貝/g活性污泥，相比于中溫培養(yǎng)減少42.2%.利用特異性熒光探針，檢測了MMB，MCC，MST 3類產(chǎn)甲烷古菌，發(fā)現(xiàn)，MMB是一類在37
℃和50 ℃均能檢測到，并大量存在的產(chǎn)甲烷古菌類群，這與董慧峪等(2014)的研究結(jié)果相一致.MCC和MST的生物量在群體中
圖 7厭氧消化菌群內(nèi)產(chǎn)甲烷古菌的生物量(注：(a).各類菌株的16S rRNA基因拷貝數(shù)占被檢測總菌株拷貝數(shù)的比例;(b)，(a)放大到0.12%(Y軸)尺度的圖像;(c).產(chǎn)甲烷古菌mcrA基因的拷貝數(shù))
較少約占檢測4種菌株總量的11%，并且在轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)后，其生物量的急劇減少，MCC甚至在菌群穩(wěn)定后消失.表明這2種產(chǎn)甲烷古菌并不適宜于50
℃條件下生長.Clostridium thermocellum是一株嚴(yán)格厭氧的纖維素分解菌株，廣泛存在于含有纖維素基質(zhì)的厭氧降解環(huán)境.C.
thermocellum
是一株能夠在高溫良好生長的菌株，在本文中，轉(zhuǎn)入高溫后生物量反而小于常溫培養(yǎng)，推測為厭氧消化體系以不含纖維素糖蜜廢水為主，因缺乏適宜的代謝底物，隨著厭氧消化體系運(yùn)行時(shí)間的延長，生物量逐漸衰退.
4 討論
在厭氧消化過程，溫度通常是影響微生物菌群的顯著因子，影響微生物的生長和生存.本研究將37 ℃的厭氧消化菌群直接提溫至50
℃馴化培養(yǎng)，在溫度和底物的選擇壓力下，原始菌群結(jié)構(gòu)經(jīng)過劇烈的變化調(diào)整后逐漸適應(yīng)新的溫度條件，并具有產(chǎn)甲烷的功能.通常在厭氧消化菌群馴化中，多采用中溫菌群梯度升溫的方法獲得高溫厭氧消化菌群，如歐陽二明等等采用序梯度升溫方法將中溫活性污泥(35
℃)馴化為高溫處理熱水解污泥的菌群.李超偉等以食堂餐廚垃圾為原料，采用中溫沼液作為菌種經(jīng)緩慢升溫成功啟動(dòng)了高溫處理餐廚垃圾的厭氧消化裝置.在本研究中通過一步直接提溫的方法也可獲得高溫厭氧消化高濃度有機(jī)廢水菌群，這與Ahring、Tian和Raskin的觀點(diǎn)相一致.
一些中溫厭氧消化菌群中常存在適宜于高溫生長的功能菌株，這部分菌株并不會(huì)在中溫條件下的長期培養(yǎng)而丟失.無論本研究中將分解禽畜糞便的中溫厭氧消化菌群直接轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)，獲得高溫厭氧消化菌群，還是利用梯度升溫法獲得高溫厭氧消化菌群，其結(jié)果均能使存在于中溫菌群中的高溫功能菌株活化并富集為優(yōu)勢菌群而發(fā)揮功能.其區(qū)別在于菌群在溫度改變過程中所面臨的選擇壓力大小.顯然，直接提升溫度的方法增加了這種選擇壓力.
在菌群結(jié)構(gòu)變遷過程中，細(xì)菌的變化程度較古菌強(qiáng)烈.Gobema等研究認(rèn)為，細(xì)菌具有非常高的多樣性，在常溫厭氧反應(yīng)器內(nèi)，其種類豐富程度遠(yuǎn)高于古菌.本研究中，當(dāng)培養(yǎng)溫度提高以后，大量DGGE條帶或消失、或新增，表明菌群內(nèi)一些無法適應(yīng)新培養(yǎng)溫度菌株的生物量驟減，而適應(yīng)高溫生長細(xì)菌菌株的生物量增加并占據(jù)了活躍的主導(dǎo)地位.與細(xì)菌菌群相比較，古菌菌群的多樣性變異較為平緩，這除了與古菌種類較少(圖
3、5、6)有關(guān)，可能也和古菌生長周期長、生長緩慢有關(guān).細(xì)菌因其生長速度快，菌群結(jié)構(gòu)更新周期短，表現(xiàn)為細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變異劇烈.
5 結(jié)論
1) 37 ℃培養(yǎng)的中溫厭氧消化產(chǎn)甲烷菌群直接轉(zhuǎn)入50 ℃高溫馴化處理高濃度糖蜜有機(jī)廢水，厭氧消化過程能夠快速啟動(dòng)并生成甲烷，并在22
d后形成穩(wěn)定的高溫厭氧消化產(chǎn)甲烷菌群，平均甲烷生成效率為162.5 mL·g-1.穩(wěn)定產(chǎn)氣期間乙酸和丙酸的質(zhì)量濃度分別為25.3和145.3
mg·L-1.
2)
菌群結(jié)構(gòu)及多樣性在高溫馴化過程中發(fā)生劇烈變化，細(xì)菌強(qiáng)于古菌，并逐漸穩(wěn)定成為以細(xì)菌(Thermacetogenium，Acetomicrobium)以及產(chǎn)甲烷古菌(Methanosaeta，Methanoculleus)為主要優(yōu)勢菌群的高溫厭氧消化菌群.
3) 所獲高溫厭氧消化產(chǎn)甲烷菌群，其產(chǎn)甲烷古菌的總生物量明顯下降，大約為7.6×106拷貝/g活性污泥.
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